引言
恩塞芬汀化学名为 (E)-1-(2-(2-(均三甲苯基亚胺基)-9,10-二甲氧基-4-氧代-6,7-二氢-2H-嘧啶并[6,1-a]异喹啉-3(4H)-基)乙基)脲（图1），是一种吸入性双重磷酸二酯酶（PDE）抑制剂，可作用于PDE3和PDE4，适用于成人慢阻肺病的维持治疗[1].由Verona Pharma公司开发用于治疗呼吸系统疾病，2024年6月，美国FDA批准使用恩塞芬汀（OHTUVAYRE）™作为成人慢性阻塞性肺病患者维持治疗[2].恩塞芬汀在针对慢阻肺患者的临床二期研究中，该药物单独使用或与现有标准治疗联合使用时，可显著改善支气管扩张效果和患者生活质量.目前处于临床开发的晚期阶段，已完成两项三期临床试验（NCT04535986和NCT04542057），用于慢阻肺患者的维持治疗[3].恩塞芬汀是首个顺利完成三期临床试验的PDE抑制剂，其耐受性和安全性良好，不良反应发生率低[4].恩塞芬汀可增强肺内皮屏障，防止耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）诱发的肺内皮屏障破坏，并以剂量依赖性方式显著抑制了MRSA诱导的白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-8（IL-8）水平来发挥抗炎作用[5].恩塞芬汀降低了慢阻肺患者肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）的生成发挥抗炎作用，且可通过PDE3-PKG-cGMP通路发挥抗氧化应激效应[6].
图1
恩塞芬汀的原研专利虽然公开了恩塞芬汀的合成方法和基本核磁共振（NMR）数据[7]，但迄今文献中未见详细的NMR信号归属.该化合物存在3个六元环并和体系，环中含有两个氮原子，整个分子含有多个季碳，在NMR信号归属上存在一定的难点.原研专利使用CDCl3为溶剂，NH和NH2的质子信号呈现宽单峰，无法确认耦合关系，不利于信号归属.本文用DMSO-d6做溶剂，一方面提高样品溶解度，使样品的二维NMR谱信号较强，另一方面更有助于指认活泼氢信号的耦合关系.二维NMR波谱法在结构鉴定[8]和结构解析[9]方面应用广泛，本文综合利用多种二维NMR技术对恩塞芬汀的NMR波谱数据进行详细归属，为恩塞芬汀后续进行定量NMR提供理论依据，便于使用qNMR监测该化合物的纯度.恩塞芬汀原料药的准确结构解析还将为其相关杂质的结构鉴定提供重要的波谱学依据，为恩塞芬汀后续研究工作提供参考.
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
恩塞芬汀（上海毕得医药科技股份有限公司，批号BD01492811），氘代DMSO（安徽泽升科技股份有限公司，批号E090002，氘代率99.8%），Bruker Avance III核磁共振波谱仪（Bruker 公司，400 MHz），配备5 mm BBO正相宽带探头.
1.2 NMR实验
1.2.1 实验参数
1H NMR和13C NMR的工作频率分别为400.13和100.61 MHz，实验温度为25 ℃，谱宽分别为8 012.82 Hz和24 038.46 Hz.二维谱包括2D梯度场COSY、HSQC、HMBC及NOESY谱.COSY的F2（1H）和F1（1H）维的谱宽均为3 472.22Hz，采用cosygpmfqf脉冲序列，采样数据点阵t2×t1 = 2 048×128，累加次数16；HSQC的F2（1H）和F1（13C）维的谱宽分别为3 472.22 Hz和16 603.18 Hz，采用hsqcetgp脉冲序列，采样数据点阵t2×t1= 1 024×512，累加次数8；HMBC的F2（1H）和F1（13C）维的谱宽分别为3 472.22 Hz 和22 138.12 Hz，采用hmbcgpndqf脉冲序列，采样数据点阵t2×t1 = 4 096×256，累加次数16；NOESY的F2（1H）和F1（1H）维的谱宽均为2 840.909 Hz，采用noesygpphpp脉冲序列，采样数据点阵t2×t1 = 4 096×512，累加次数16，混合时间D8 = 0.3 s；一维选择性激发NOESY谱宽为8 012.820 Hz，采用selnogp脉冲序列，激发δH 1.97氢原子核，累加次数为7 168，混合时间D8 = 0.25 s.
1.2.2 实验方法
称取恩塞芬汀约8 mg，用0.6 mL DMSO-d6 溶解，以TMS为内标（δH 0.00），待所有固体完全溶解后，转移该溶液至直径5 mm NMR样品管中进行1H NMR谱测试.
称取恩塞芬汀约20 mg，用0.6 mL DMSO-d6 溶解，以TMS为内标（δH 0.00），待所有固体完全溶解后，转移该溶液至直径5 mm NMR样品管中进行13C NMR和二维NMR谱测试.
2 实验结果
本文以DMSO-d6为溶剂采集了恩塞芬汀的一维1H NMR谱（图2）、全去耦碳谱和DEPT135谱（图3）. 在1H NMR谱中，δH 2.50为DMSO-d6的溶剂残留峰，δH 3.33为DMSO-d6中残留的水峰.恩塞芬汀为具有4个环系的脲类衍生物，在HSQC谱（图4）中，δH 6.17、5.47无直接相关的碳信号，推测δH 5.47为1号位-NH2上的氢（H-1），δH 6.17为3号位-NH上的氢（H-3）.在HSQC谱中，δC 37.3与δH 3.33相关，则提示该氢信号与水峰信号重叠，结合DEPT135谱可推测该氢信号为CH2信号.在COSY谱（图5）中，δH 3.33与δH 6.17（H-3）、4.18相关，则δH 3.33归属为H-4，δH 4.18归属为H-5.在1H NMR中，δH 1.97为含有6个氢信号的单重峰，推测δH 1.97为处在对称位置的2个甲基上的氢（H-3'、H-5'）；δH 2.21为含有3个氢的单重峰，推测δH 2.21为H-4'.在HSQC中，δC 128.8与δH 6.85具有相关性；在HMBC（图6）中，δH 2.21（H-4'）与δC 128.8具有相关性，则证明δH 6.85处在对称位置的苯环上的2个氢（H-20、H-22）.在NOESY谱（图7）中，δH 1.97（H-3'、H-5'）与δH 6.85、5.32具有较强相关信号.对δH 1.97（H-3'、H-5'）进行1D NOESY选择性激发实验的结果如图8所示，δH 1.97（H-3'、H-5'）与δH 6.85、6.66、6.17、5.47、5.32、4.18、3.92、3.33具有相关性，结合恩塞芬汀的结构，H-7为烯烃H，推测δH 5.32为H-7；δH 6.66与δH 3.61、5.32（H-7）相关，则δH 6.66为H-10，δH 3.61为H-1'；δH 6.96与δH 3.80、δH 2.90相关，则δH 6.96为H-13，δH 3.80为H-2'，δH 2.90推测为H-15.在HSQC谱，δC 111.9与δH 6.96相关，则δC 111.9为C-13，结合HMBC谱，δH 2.90与δC 111.9（C-13）具有相关性，可进一步验证δH 2.90为H-15.在COSY谱中，δH 3.92与δH 2.90（H-15）相关，则δH 3.92为H-16.根据以上一系列图谱，完成了图2中1H NMR谱中恩塞芬汀所有信号归属.
图2
图3
图3
恩塞芬汀13C NMR谱图(a)和DEPT135谱图(b)
Fig. 3
The 13C NMR (a) and DEPT135 (b) spectra of ensifentrine
图4
图5
图6
图6
恩塞芬汀HMBC谱图(a)及其局部放大谱图(b)
Fig. 6
The HMBC spectrum (a) and partial enlarged HMBC spectrum (b) of ensifentrine
图7
图7
恩塞芬汀NOESY谱图(a)和NOESY局部放大谱图(b)
Fig. 7
The NOESY spectrum (a) and partial enlarged NOESY spectrum (b) of ensifentrine
图8
恩塞芬汀分子式为C26H31N5O4，一共有26个碳，有3组碳（C-20与C-22、C-19与C-23、C-3'与C-5'）处在对称位置，化学环境相同，理论上应有23种化学环境不同的碳原子.在图3(a)的13C NMR谱中，除溶剂峰碳信号外，一共有22组碳信号.在HSQC谱中，δH 3.92（H-16）与δC 40.6相关，推测C-16信号隐藏在DMSO-d6残留峰中.化合物中含有11个季碳，环系季碳的归属是该结构解析难点，本文尝试利用HMBC谱对其进行归属.HMBC谱中（图6），季碳δC 148.3与δH 3.61（H-1'）具有相关性，因此将δC 148.3归属为C-11；季碳δC 152.2与δH 3.80（H-2'）具有相关性，因此将δC 152.2归属为C-12；δH 6.17（H-3）、δH 3.33（H-4）与季碳δC 159.2相关，因此将δC 159.2归属为2号位羰基碳即C-2；δH 4.18（H-5）、δH 3.92（H-16） 与季碳δC 151.4相关，因此将δC 151.4归属为C-17；δH 2.21（H-4'）与季碳δC 130.7、δC 128.8相关性较强，结合HSQC谱，δC 128.8与δH 6.85（H-20/H-22）相关，因此δC 128.8可归属为C-20/C-22，δC 130.7则归属为C-21；δH 6.85（H-20）与季碳δC 144.5相关性较强，因此将δC 144.5归属为C-23；δH 6.85（H-20/H-22）、δH 1.97（H-5'）均与季碳δC 128.2相关，故将δC 128.2归属为C-18；δH 2.90（H-15）与季碳δC 119.4、季碳δC 131.1 具有相关性，δH 5.32（H-7）与季碳δC 142.8、季碳δC 119.4具有相关性，δH 6.96（H-13）与季碳δC 131.1、季碳δC 119.4具有相关性，分析这3个氢相关性差异，将δC 142.8归属为C-8，δC 119.4归属为C-9，δC 131.1 归属为C-14；δH 5.32（H-7）与季碳δC 148.6、δC 142.8（C-8）具有相关性，则将δC 148.6归属为C-6.其余碳信号均非季碳，可通过DEPT135区分-CH、-CH2、-CH3，再结合其化学位移特点和HSQC谱进行快速归属，从而完成13C NMR谱信号归属.恩塞芬汀1H NMR和13C NMR谱信号归属见表1.恩塞芬汀关键COSY和关键NOE相关信号示意图见图9，关键HMBC相关信号示意图见图10.
表1 恩塞芬汀1H、13C NMR信号归属
Table 1
| Position | δC | δH (J/Hz) | HSQC | NOESY | HMBC | COSY |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | / | 5.47, s, 2H | / | H-3 | / | / |
| 2 | 159.2 | / | / | / | H-4 | / |
| 3 | / | 6.17, s, 1H | / | H-1, H-4, H-5, H-3' | / | H-4 |
| 4 | 37.3 | 3.33, m, 2H | + | H-3', H-3, H-5, | H-5 | H-3,H-5 |
| 5 | 42.0 | 4.18, t, (6.8), 2H | + | H-3, H-4 | H-4 | H-4 |
| 6 | 148.6 | / | / | / | H-5, H-7 | / |
| 7 | 88.2 | 5.32, s, 1H | + | H-5', H-10 | / | / |
| 8 | 142.8 | / | / | / | H-7, H-10, H-16 | / |
| 9 | 119.4 | / | / | / | H-7, H-10, H-13, H-15 | / |
| 10 | 109.1 | 6.66, s, 1H | + | H-1', H-7, H-5' | / | / |
| 11 | 148.3 | / | / | / | H-10, H-13, H-1' | / |
| 12 | 152.2 | / | / | / | H-10, H-13, H-2' | / |
| 13 | 111.9 | 6.96, s, 1H | + | H-2', H-15 | H-15 | / |
| 14 | 131.1 | / | / | / | H-10, H-13, H-15, H-16 | / |
| 15 | 27.5 | 2.90, t, (5.6), 2H | + | H-13, H-16 | H-16, H-13 | H-16 |
| 16 | 40.6 | 3.92, t, (5.7), 2H | + | H-15 | / | H-15 |
| 17 | 151.4 | / | / | / | H-5, H-16 | / |
| 18 | 128.2 | / | / | / | H-22, H-5' | / |
| 19, 23 | 144.5 | / | / | / | H-22, H-5' | / |
| 20, 22 | 128.8 | 6.85, s, 2H | + | H-4', H-5' | H-4' | / |
| 21 | 130.7 | / | / | / | H-4' | / |
| 1' | 56.6 | 3.61, s, 3H | + | H-10 | / | / |
| 2' | 56.2 | 3.80, s, 3H | + | H-13 | / | / |
| 3',5' | 18.5 | 1.97, s, 6H | + | H-3, H-4, H-7,H-10, H-22 | H-22 | / |
| 4' | 20.9 | 2.21, s, 3H | + | H-22 | H-22 | / |
图9
图9
恩塞芬汀关键COSY和NOE相关信号
Fig. 9
The key COSY and NOE correlations of ensifentrine
图10
3 结论
本文选择DMSO-d6为溶剂，利用一维及二维NMR实验对恩塞芬汀原料药进行1H、13C具体信号归属.利用1H NMR、COSY、HSQC谱并结合NOESY谱，进行氢原子信号归属，鉴别出1个隐藏在水峰中的亚甲基信号；利用一维选择性激发NOESY实验选择性照射δH 1.97（H-3'、H-5'），确证了该氢的NOESY相关信号；利用碳谱、DEPT135谱区分伯、仲、叔、季碳；利用HSQC，进行-CH、-CH2、-CH3信号归属；进一步利用HMBC，完成11个季碳的信号归属.
利益冲突
无
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